الاستخدام المشترك

الإجار هو نوع من أداة تحليلية هامة جدا ، سواء في الفيزياء ، الكيمياء ، علم الأحياء ، الطب ، علم المواد ، العلوم البيئية ، وغيرها من مجالات البحث العلمي ، أو في الصناعة الكيميائية ، والطب ، والبيئة ، والتفتيش ، والتعدين ، وغيرها من الإنتاج الحديثة وإدارة الإدارات ، الأشعة فوق البنفسجية مرئية طيفي الإشراف على مجموعة واسعة من التطبيقات الهامة . الإجار هو أداة تستخدم في التحليل الكمي والنوعي من المواد من خلال طريقة طيفية .

ultramicro الإجار أصبح أداة روتينية في مختبر البيولوجيا الجزيئية الحديثة . وهي تستخدم عادة في قياس الأحماض النووية والبروتينات ، فضلا عن تركيز نمو البكتيريا .

كمية الحمض النووي

كمية الحمض النووي هو وظيفة عالية التردد باستخدام ultramicro الإجار . اليغنوكليوتيد ، واحد الذين تقطعت بهم السبل ، الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والجيش الملكي النيبالي يمكن كميا للذوبان في العازلة . ذروة امتصاص عالية من الحمض النووي هو 260nm . كل جزيء الحمض النووي يتكون من جزيئات مختلفة ، وبالتالي فإن معامل التحويل مختلفة . تحديد أنواع مختلفة من الأحماض النووية ، واختيار معامل المقابلة مقدما . على سبيل المثال ، امتصاص الضوء من 1 التطوير التنظيمي يساوي 50 ميكروغرام / مل dsdna 37 ميكروغرام / مل من ssdna 40 ميكروغرام / مل من الحمض النووي الريبي ، 30 ميكروغرام / مل من أوليغ ، على التوالي . بعد اختبار امتصاص الضوء قيمة معامل التحويل المذكورة أعلاه ، وبالتالي الحصول على عينة المقابلة التركيز . قبل الاختبار ، حدد الإجراء الصحيح ، أدخل حجم السائل الأصلي المخفف ، ثم اختبار فارغة عينة السائل . ومع ذلك ، فإن التجربة ليست سهلة الإبحار . عدم الاستقرار في القراءة قد يكون الصداع في المواضيع . أعلى حساسية الصك ، أكبر امتصاص الانجراف .

في الواقع ، فإن مبدأ تصميم و مبدأ العمل من الإجار يسمح امتصاص قيمة التغيير في نطاق معين ، وهذا هو ، أداة لديها درجة معينة من الدقة والدقة . على سبيل المثال ، دقة بيرغ كوليبري ultramicro الإجار هو أقل من 1 ٪ ( 1 ) . نتائج هذه الاختبارات تختلف من 1 في المائة في المتوسط . وبالإضافة إلى ذلك ، ينبغي النظر في الخصائص الفيزيائية والكيميائية من الحمض النووي نفسه ، ودرجة الحموضة ، تركيز أيون حل العازلة من الحمض النووي ، وما إلى ذلك : في الاختبار ، تركيز أيون عالية جدا ، وسوف يؤدي أيضا إلى قراءة الانجراف ، لذلك اقترح استخدام قيمة الرقم الهيدروجيني معينة ، وانخفاض تركيز أيون العازلة ، مثل تي ، يمكن أن تكون مستقرة إلى حد كبير في القراءة . تمييع تركيز العينة هو أيضا عامل مهم : لأن هناك بعض الجسيمات الدقيقة في العينة ، لا سيما الحمض النووي عينة . وجود هذه الجزيئات الصغيرة يتداخل مع نتائج الاختبار . من أجل الحد من تأثير الجسيمات على نتائج الاختبار إلى حد كبير ، وامتصاص الضوء قيمة الحمض النووي يجب أن يكون على الأقل أكثر من 0.1a ، وامتصاص الضوء قيمة جيدة في 0.1-1.5a . . . . . . . وهذا يعني أن تركيز العينة لا ينبغي أن تكون منخفضة جدا أو عالية جدا ( خارج نطاق اختبار مضواء ) . عوامل التشغيل ، مثل الاختلاط يجب أن تكون كافية ، وإلا فإن قيمة امتصاص الضوء منخفضة جدا ، أو حتى قيمة سلبية . لا يمكن أن يكون هناك فقاعات في السائل مختلطة ، لا تعليق في السائل فارغة ، وإلا فإن القراءة الانجراف بعنف . يجب استخدام نفس كأس اللونية لاختبار السائل فارغة والعينات ، وإلا فإن تركيز الفرق كبير جدا . اختيار معامل التحويل و تركيز العينة وحدة متسقة . لا تستخدم نافذة ارتداء كأس اللونية . حجم العينة يجب أن تصل إلى حجم صغير من كأس اللونية وغيرها من المسائل التشغيلية .

وبصرف النظر عن تركيز الحمض النووي ، الطيف يظهر أيضا العديد من النسب الهامة جدا التي تشير إلى نقاء العينة ، مثل نسبة A260 / A280 ، وتستخدم لتقييم نقاء العينة ، لأن ذروة امتصاص البروتين 280nm . عينة نقية ، نسبة أكبر من 1.8 ( الحمض النووي ) أو 2 ( الحمض النووي الريبي ) . إذا كانت النسبة أقل من 1.8 أو 2.0 ، فإنه يدل على وجود تأثير البروتين أو الفينول . a230 يشير إلى وجود بعض الملوثات في العينة ، مثل الكربوهيدرات ، ببتيد ، * الخ ، نقية نسبيا نسبة الحمض النووي a260 / a230 أكبر من 2.0 . A320 بالكشف عن التعكر وغيرها من العوامل المزعجة من الحل . عينات نقية ، A320 عموما 0 .

كمية البروتين مباشرة

هذا الأسلوب هو اختبار البروتين مباشرة في 280nm الطول الموجي . اختيار صيغة واربورغ ، الضوء يمكن أن تظهر مباشرة تركيز العينة ، أو اختيار طريقة التحويل المقابلة ، سيتم تحويل قيمة امتصاص الضوء في تركيز العينة . عملية تحديد البروتين هو بسيط جدا ، أولا اختبار السائل فارغة ، ثم اختبار البروتين مباشرة . لأن هناك بعض الشوائب في المخزن المؤقت ، عموما إزالة 320nm " الخلفية " المعلومات ، تعيين هذه الوظيفة " على " . على غرار اختبار الحمض النووي ، امتصاص الضوء من قيمة a280 يجب أن يكون على الأقل أكثر من 0.1a ، مجموعة خطية بين 1.0 و 1.5 . عند اختيار صيغة واربورغ لإظهار تركيز العينة ، قراءة " الانجراف " . هذه ظاهرة طبيعية . في الواقع ، طالما أن قيمة امتصاص الضوء a280 لاحظ مجموعة متنوعة من أقل من 1 ٪ ، مما يدل على أن النتائج مستقرة جدا . الانجراف هو بسبب امتصاص الضوء قيمة واربورغ صيغة تحويلها إلى تركيز ، مضروبة في معامل معينة ، طالما أن قيمة امتصاص الضوء يتغير قليلا ، وسوف يكون التركيز الموسع ، وبالتالي فإن النتائج غير مستقرة للغاية . الهدف من وضع طريقة مباشرة لتحديد كمية البروتين . مقارنة مع قياس الألوان ، الأشعة فوق البنفسجية طريقة سريعة وبسيطة . ولكن من السهل أن تتداخل مع المواد الموازية ، مثل الحمض النووي . وبالإضافة إلى ذلك ، حساسية منخفضة ، وارتفاع تركيز البروتين المطلوب .

تحديد البروتين اللونية

البروتين هو عادة مجمع العديد من البروتينات ، على أساس قياس الألوان هو تكوين البروتين : الأحماض الأمينية ( على سبيل المثال ، * * * * * * * * * * * * * * ) تتفاعل مع إضافة لون أو صبغ مجموعات لإنتاج المواد الملونة . تركيز المواد الملونة يرتبط مباشرة مع عدد من الأحماض الأمينية التي تتفاعل مع البروتين ، مما يعكس تركيز البروتين .

هناك العديد من الأساليب اللونية مثل اتفاق التعاون الأساسي ، برادفورد ، لوري ، وهلم جرا .

لوري الأسلوب : استنادا إلى أوائل بيورت فعل ، مع بعض التحسينات . البروتين يتفاعل مع cu2 لإنتاج الأزرق المتفاعلة . ومع ذلك ، مقارنة مع بيورت ، لوري الأسلوب هو أكثر حساسية . العيب هو أنه يحتاج إلى إضافة عدة أنواع مختلفة من الكواشف في التسلسل . يستغرق وقتا أطول للرد . عرضة nonprotein المواد ؛ البروتينات التي تحتوي على مواد مثل يدتا ، tritonx-100 ، ammoniasulphate ليست مناسبة لهذا الأسلوب .

BCA ( BCA ) : هذا هو جديد ، أكثر حساسية من البروتين طريقة الاختبار . البروتين إلى تحليل يتفاعل مع cu2 في محلول قلوي لإنتاج النحاس ، والتي تشكل شيلاتينغ مجمع مع اتفاق التعاون الأساسي لتشكيل مجمع الأرجواني مع ذروة الامتصاص في 562nm الطول الموجي . العلاقة الخطية بين هذه المركبات و تركيز البروتين * ، و رد الفعل على شكل مركبات مستقرة جدا . بالمقارنة مع لوري الأسلوب ، عملية بسيطة وحساسة . ولكن على غرار لوري الأسلوب ، فإنه من السهل أن تكون منزعجة من البروتينات والمنظفات .

برادفورد الأسلوب : مبدأ هذا الأسلوب هو أن البروتين يتفاعل مع كوماسي الزرقاء الرائعة ، مما أسفر عن امتصاص المركبات الملونة الذروة 595nm . . . . . . . عملية أبسط وأسرع . واحد فقط رد فعل كاشف مطلوب . المجمع يمكن أن تكون مستقرة لمدة 1 ساعة ، مع نتائج مريحة ؛ و متوافق مع سلسلة من الحد من وكلاء ( مثل DTT ، mercaptoethanol ) التي تتداخل مع لوري ، اتفاق التعاون الأساسي من ردود الفعل . ولكن لا تزال حساسة المنظفات . العيب الرئيسي هو أن معايير مختلفة يمكن أن يؤدي إلى نتائج مختلفة من نفس العينة ، لا يمكن مقارنتها .

بعض الباحثين في الاتصال الأولي قياس الألوان قد تكون في حيرة من نتائج مختلفة من قياس الألوان ، ما هي الطريقة التي ينبغي أن نعتقد ؟ لأن رد فعل مجموعات مختلفة من أساليب مختلفة و لون مجموعات مختلفة ، في وقت واحد باستخدام عدة طرق للحصول على نفس العينة تركيز العينة لا يمكن مقارنتها . على سبيل المثال : كيلر وآخرون اختبار البروتين في الحليب البشري ، نتائج لوري ، اتفاق التعاون الأساسي في تحديد تركيزات أعلى بكثير من برادفورد ، فرق كبير . حتى لو كان نفس العينة التي تم تحديدها ، عينة القياسية التي تم اختيارها من قبل نفس الأسلوب اللونية ليست متسقة ، والتركيز بعد الاختبار ليست متسقة . على سبيل المثال ، لوري كان يستخدم للكشف عن البروتين في خليط من الخلايا ، جيش صرب البوسنة كان يستخدم معيار تركيز 1.34mg / ml ، الجلوبيولين كان يستخدم معيار تركيز 2.64mg / ml . . . . . . . ولذلك ، قبل اختيار طريقة قياس الألوان ، مع الإشارة إلى التركيب الكيميائي من العينة التي سيتم اختبارها ، ونحن العثور على البروتينات القياسية مع التركيب الكيميائي مماثلة . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن المشكلة الشائعة في تحديد البروتين من خلال قياس الألوان هو أن امتصاص الضوء قيمة العينة منخفضة جدا ، مما يؤدي إلى فجوة كبيرة بين قياس تركيز العينة و التركيز الفعلي . المشكلة الرئيسية هي أنه بعد رد فعل 1011 الإجار هو جزء مهم من لون كأس اللونية التي لديها بعض نصف الحياة ، لذلك كل طريقة اللونية يسرد وقت رد الفعل ، ويجب اختبار جميع العينات ( بما في ذلك العينات القياسية ) في هذا الوقت . وقت طويل جدا ، الحصول على قيمة امتصاص الضوء يصبح أصغر و تحويل قيمة تركيز النقصان . وبالإضافة إلى ذلك ، فإن درجة حرارة التفاعل و قيمة الرقم الهيدروجيني من الحل هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على التجربة . وعلاوة على ذلك ، من المهم جدا أن يتم استخدام البلاستيك قياس الألوان . تجنب استخدام الكوارتز أو الزجاج كأس اللونية ، لأن رد الفعل سوف تجعل لون الكوارتز أو الزجاج ، مما أدى إلى امتصاص الضوء قيمة العينة غير دقيقة .

OD600

مختبر تحديد كثافة نمو البكتيريا والبيولوجية * ، استنادا إلى الخبرة و القياسات البصرية لتحديد كثافة نمو البكتيريا . في التجارب مع ارتفاع الطلب ، من الضروري استخدام الإجار لقياس كثافة الخلية البكتيرية بدقة . od600 هو معيار طريقة تتبع نمو الكائنات الحية الدقيقة في السائل الثقافة . الثقافة المتوسطة التي لا تحتوي على البكتيريا السائل يستخدم السائل فارغة ، ثم الثقافة المتوسطة التي تحتوي على البكتيريا بعد الثقافة الكمية . من أجل ضمان التشغيل الصحيح ، يجب أن يكون هناك منحنى المعايرة لكل ميكروب و كل جهاز عد الخلايا مع المجهر . في بعض الأحيان ، قيمة التطوير التنظيمي من البكتيريا السائل يظهر قيمة سلبية ، لأن الثقافة المتوسطة التي تستخدم اللون ، وهذا هو ، بعد فترة من الزمن ، ثقافة البكتيريا المتوسطة ، رد فعل ، رد فعل اللون . وبالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن عينات الاختبار لا يمكن أن يكون الطرد المركزي للحفاظ على البكتيريا تعليق .