في الفترة السابقة من فئة النمساوية الصغيرة و الجميع يتحدثتطوير منهجية إليسا - تطوير أساليب الكشف عن كمية الجزيئات الحيويةمنتدى
هذا العدد من النمساوية الصغيرة مرة أخرى أن أشاطركم موضوع هام آخر : " إليسا منهجية تطوير الممارسة - تقارب طريقة الاختبار .

أولاً - مقدمة

الأساليب الحالية لتحديد تقارب بين يغاندس المستقبلات ، وهذا هو ، ثابت تفكك التوازن ، تشمل ما يلي :

1. طريقة القياس الحرارية
2. طريقة القياس الحركية
3. طريقة تركيز التشبع

من بينها ، حركية و تشبع تركيز أكثر شيوعا .طريقة القياس الحركية( مثل بياكور )فيما يتعلق باستثمار أدوات أكثر تكلفة ،طريقة قياس تركيز التشبع هو طريقة شائعة في معظم الشركات المحلية في مجال الأدوية البيولوجية .

اليسا هو السائد في طريقة قياس تركيز التشبع ، وغالبا ما تستخدم في تقييم نشاط مستضد البروتين أو مستوى الأجسام المضادة وتقييم استقرار الأجسام المضادة .
إليسا المستخدمة في تحديد تقارب في كثير من الأحيان لا يكون تجاريا عدة ، تحتاج إلى تطوير منهجية من قبل مختبر الموظفين .

بسبب الافتقار إلى التعليم في مجال التكنولوجيا الحيوية ، وتراكم شركات تطوير العقاقير الجديدة في هذا التطبيق ، إليسا تقارب طريقة الاختبار التي يمكن التحقق منها من خلال منهجية من الصعب جدا على العديد من الممارسين ، و من المرجح أن يكون هناك بعض المغالطات مثل خطأ في نقل الإشارات الجديدة أو الانحراف .
واحدة من المغالطات هو تطوير طريقة الاليزا تقارب المقايسات على أساس كمية اليسا الظروف التجريبية .

في هذه الورقة ، على أساس مبدأ تحديد طريقة تقاربوتصف هذه الورقة المبادئ الأساسية لقياس تقارب تركيز التشبع ، يلخص العلاقة بين الجرعة مستضد الضد في تطوير إليسا ، و بعض الأخطاء التي قد تحدث في تطبيق إليسا في تحديد تقارب .

المفاهيم الأساسية من الألفة

من خلال تحليل بعض التفاعلات الكيميائية ، ونحن شرح ما يسمى تقارب .

例子A
الهيدروجين والاوكسجين تنتج الماء تحت ظروف الإضاءة .
عندما يتوقف رد الفعل ، إذا كان تركيز المولي الهيدروجين يحدث أن تكون مرتين كما كبيرة كما أن الأكسجين في رد فعل البيئة ، وكلاهما يستهلك الماء فقط في رد فعل البيئة . إذا كان تركيز المولي من الهيدروجين هو أكثر من ضعف تركيز المولي من الأكسجين ، والأكسجين يستهلك فقط الهيدروجين والماء في رد فعل البيئة . إذا كان تركيز الهيدروجين المولي أقل من مرتين من تركيز الأكسجين المولي ، الهيدروجين يستهلك فقط الأكسجين والماء في رد فعل البيئة .
هذه هي المعرفة الأساسية حول التفاعلات الكيميائية ، نتائج التفاعلات الكيميائية ، المتفاعلة يمكن أن تتحول إلى منتج ، وهذا هو ، يمكن أن يكون رد فعل في النهاية ، مثل عملية رد الفعل والنتيجة من خصائص رد فعل يسمى رد فعل لا رجعة فيه .

例子B
مستضد PD1(CD279)PD1 الضدمثل بيمبروليزوماب)رد فعل في درجة الحرارة العادية والضغط الجوي .
عندما يتوقف رد الفعل ، إذا كان تركيز المولي من cd279 200 نانومتر و تركيز المولي من pembrolizumab هو 100 نانومتر ، تركيز المولي من pembrolizumab-cd279 مجمع 97.86nm ، تركيز المولي من cd279 4.28nm و pembrolizumab 2.14nm تحت ظروف مثالية .
إذا كان تركيز المولي من cd279 هو 100 نانومتر و تركيز المولي من pembrolizumab هو 200 نانومتر ، تركيز المولي من pembrolizumab-cd279 مجمع 49.81nm 0.38nm , و 159.19nm تحت ظروف مثالية .

مثال ج
مستضد PD1(CD279)pdl1 مستضد ، pdl1(CD274)رد فعل في درجة الحرارة العادية والضغط الجوي .
إذا كان تركيز المولي من cd279 في رد فعل البيئة 200nm و 100nm ، وتركيز cd274-cd279 2.35nm , و 197.65nm cd279 , و 97.65nm عند الانتهاء من رد الفعل .
إذا كان تركيز المولي من cd279 في رد فعل البيئة هو 100 نانومتر ، تركيز المولي من cd274 هو 200 نانومتر ، وتركيز cd274-cd279 مجمع 2.35nm ، تركيز المولي cd279 97.65nm ، تركيز المولي cd274 هو 197.65nm ، ومعظم cd279 و cd274 لم تشارك في رد الفعل .
في الحالتين باء وجيم ، سواء مستضد الضديغاندس المستقبلاتاثنين من ردود الفعل الإيجابية في عملية تشكيل معقدة ، ولكن أيضا عملية التفكك معقدة لإنتاج مستضد ، رد فعل عكسي من الأجسام المضادة ، والنتيجة النهائية هي حالة من التعايش بين مستضد ، مستضد الضد مستضد الضد المعقدة .

هذا الرد يسمىرد فعل عكسيمنتدى
عندما تكون سرعة رد فعل إيجابي و رد فعل عكسي على قدم المساواة في رد فعل عكسي ، تركيز مستضد ، تركيز الأجسام المضادة و تركيز مستضد الضد المعقدة في نظام رد فعل لم تعد زيادة أو نقصان .

تقارب(الارتباط)هي معلمة مميزة من الدولة النسبية بين مستضد ، مستضد الضد و antigen-antibody المعقدة في عملية رد فعل عكسية .( بما يتفق مع وحدة التركيز )منتدى

أصغر عدد من النسب ، أقوى النسب ، و قوة النسب يحدد نسبة كل عنصر في رد فعل عكسي عند الانتهاء .

على سبيل المثال ، ب و ج هي نفس 200nm cd279(PD1)رد فعل الأجسام المضادة ضد pembrolizumab( PD1 الضد )بالنسبة cd279 تقارب 0.4nm ، يجند cd274(PDL1)بالمقارنة مع cd279 تقارب 8200 نانومتر ، pembrolizumab-cd279 مجمع 97.86 نانومتر ، في حين أن cd274-cd279 مجمع فقط 2.35nm 42 مرة .

على عكس ردود الفعل التي لا رجعة فيها ، مستضد الضديغاندس المستقبلاتتقارب بين اثنين سوف تؤثر على عدد من المنتجات في رد فعل عكسي .

هل تعرف المبادئ الأساسية في تطوير منهجية إليسا ؟

من أجل استعراض أساليب ومبادئ تحديد النسب ، يمكن للقراء الرجوع إلى تقييم النسب في فحص وتقييم الوظائف البيولوجية .
في هذه الورقة ، طريقة تركيز التشبع هو تلخيصها .
رممثلمتقبلأو .مستضداتولممثلاللجينأو .الأجسام المضادةمنتدى
باستخدام طريقة تركيز التشبع ، إذا كان تقارب ليجند إلى مستقبلات مصممة ، في وجود كمية صغيرة من البحث ، ل هو مخفف من التدرج ، وتركيز r-l معقدة يتم الكشف عنها .(EC50)دينار كويتي قيمة ل ص
RL / R ، أي ب قيمة يمكن أن تحل محل الكشف عن إشارة قيمة العلاقة الوظيفية بين التدرج تمييع ل و إشارة يمكن أن تلبي الصيغة التالية ، فقط في ظل ظروف تجريبية معينة EC50 قيمة يمكن أن تساوي قيمة دينار كويتي .
هناك العديد من النقاط الرئيسية في تحديد قيمة دينار كويتي من التشبع تركيز الأسلوب .وهذا هو ، اثنين من الجزيئات تتفاعل مع بعضها البعض ، ص هو أقل من ذلك ، ل هو تمييع التدرج المستمر( جميع مواقع ملزمة ص تشغلها ل )في هذه الحالة ، إذا كان نصف البحث هو المحتلة ، ل التركيز المطلوب(EC50)قيمة دينار كويتي .
إشارة القيم التي تمثل RL المجمعات هي أساسا قياس تركيز التشبع ، والتي يمكن قياس التدفق الخلوي ، العلامات النظائر مضان الاستقطاب ، أو إليسا .

تطوير أساليب إليسا المستخدمة في تحديد تقارب

تخطيط

العملية العامة

01إعداد لوحة : 100 ميكروغرام / مل مستضد حل في درجة حرارة الغرفة ، ثم تمييع في 0.2ug / مل ، 0.5ug / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، ثم إضافة 100ul / المسام في لوحة ، على التوالي .(الملاحظة 1)في هذه الدراسة ، المغلفة السائل أضيفت إلى السيطرة على الأجسام المضادة المغلفة ، 2-8 ℃ بين عشية وضحاها .
02تغسل لوحة مع سائل الغسيل 3 مرات ، بات الجافة ، إضافة 300ul / ثقب ختم السائل(الملاحظة 2)درجة حرارة الغرفة مغلقة لمدة 1 ساعة . غسل لوحة 3 مرات ، بات الجافة ؛
03الأجسام المضادة كانت مخففة مع التدرج الأولي 3 مرات من 100 ، 000 نانوغرام / مل حسب التصميم .(الملاحظة 3)، وفقا للتخطيط ، 100ul / ثقب في لوحة microporous ;
04وضع فيaohaosi microporous لوحة مذبذب (ISLDMPHDG)مجموعة 37 ℃ 600rpm التذبذب لمدة 1 ساعة .

05غسل لوحة مع سائل الغسيل 3 مرات ، بات الجافة ؛
06انزيم مرتبط الأضداد المخفف إلى التركيز المناسب(الملاحظة 4)فيأورهوس دوامة متر(VXMNFS)فوقتخلط جيدا ، 100ul / المسام ؛

07وضع لوحة microporous مذبذب في 37 ℃ و 600 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة .
08غسل لوحة مع سائل الغسيل 4 مرات ، بات الجافة ؛
09تأخذ انزيم مرتبط المناعي الأجسام المضادة المقابلة لون السائل ، قبل 20 دقيقة من استخدام الخروج من التوازن إلى درجة حرارة الغرفة ، في دوامة خلاط خلط موحد .
10إضافة اللون السائل إلى 100 ul / حفرة مع 8 صفوف من البنادق .
11لون السائل يوضع في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-30 دقيقة لتجنب الضوء(الملاحظة 5)ن
12إنهاء رد فعل باستخدام 8 قنوات التفريغ مع 100 ul / حفرة إضافة إنهاء السائل( اعتمادا على الركيزة ، هذه الخطوة قد لا تكون مطلوبة )ن
13تحديد قيمة إشارة بواسطة انزيم أداة وسم(الملاحظة 6)ن
14تحليل النتائج(الملاحظة 7)منتدى

ملاحظة صغيرة

ملاحظة 1:إذا لزم الأمر للحد من تركيزات عالية من الأجسام المضادة أثناء التفاعل(100000ng / مل)من أجل غير محددة الامتزاز على انزيم لوحة التسمية ، مسعور لوحة التسميةالبوليسترينتركيز مستضد المغلفة يحتاج إلى كمية صغيرة من 0.2-1ug / مل ، في ظروف محددة ، فإنه يحتاج إلى أن يكون الأمثل حسب تقارب مستضد الضد . في العام ، تقارب أقوى ، وانخفاض تركيز مستضد المطلوبة الكسوة .
ملاحظة 2:ختم السائل لا يمكن أن تلعب دائما تأثير الختم ، تحتاج إلى التحقق التجريبي( مجموعة من المستضدات غير المغلفة )في العام ، أقل من الوزن الجزيئي هو أفضل تأثير .
ملاحظة 3:في المرحلة الأولى من تطوير المنهجية ، تركيز مجموعة من المنحنى القياسي يمكن أن تمتد إلى 100 ، 000 نانوغرام / مل - 0.1 نانوغرام / مل للحصول على منحنى كامل من أعلى إلى أسفل منصة المرحلة .
ملاحظة 4:إذا كان اثنين من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مع ارتفاع وانخفاض درجة تمييع يمكن أن تنتج نفس الجرعة منحنى ، مما يدل على أن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مع ارتفاع وانخفاض درجة تمييع يمكن أن تنتج نفس الجرعة منحنى .
أما عن الأجسام المضادة بولكلونل انزيم مرتبط المناعي ( ELISA ) ، تمييع الحكم معقدة نسبيا ، يمكن أن تحسب في البداية أن التركيز المولي ELISA الضد هو أكثر من 5 مرات من التركيز المولي مستضد المغلفة . عندما يكون تركيز الأجسام المضادة انزيم مرتبط كانت صغيرة نسبيا ، تم القبض على الأجسام المضادة انزيم مرتبط في جرعات عالية من تركيزات مختلفة من الأجسام المضادة ، منحنى كاذبة على منصة .
ملاحظة 5:عن قيمة الامتصاصية الركيزة الفلورسنت ، إشارة الكشف عن قيمة الصك يتناسب مع لون الوقت ، ومراقبة في 10-30 دقيقة . إشارة خطية مجموعة من اختبار أداة تحتاج إلى تأكيد في وقت مبكر ، على سبيل المثال ، إشارة خطية مجموعة من قيمة الامتصاصية من العام enzymogram الصك هو 0-3 ، الامتصاصية القيمة بين 3-4 غير الخطية ، إشارة التحكم في القيمة لا ينبغي أن تتجاوز 3 عند وضع اللون ، عند إشارة قيمة تتجاوز مجموعة خطية ، منحنى لديه منصة زائفة .
ملاحظة 6:ركائز مختلفة تحتاج إلى استخدام أدوات مختلفة للكشف عن قيمة القراءة ، قراءة قيمة مضان تشيميلومينيسسينسي قراءة القيمة . في عملية اختيار الركيزة ، وإيلاء الاهتمام إلى ما إذا كان أو لم يكن مختبر العلامات الانزيم لديه وظيفة من هذا النوع من القراءة .
ملاحظة 7:الجرعة القياسية منحنى المناسب عادة ما تكون مزودة أربع معلمات .( أ ، د )المنحدر هو عادة 0.8-1.2( ب ) القيمةبين EC50（قيمة ج (تقارب الأجسام المضادة للمستضد

خامساً - ملخص

وفقا لطريقة تركيز التشبع ، من الضروري أن يكون هناك أربع معلمات s-curve ، وهذا هو ، يجب أن يكون هناك إشارة المنحنى الذي يتغير تدريجيا مع تركيز الأجسام المضادة .
في تركيزات منخفضة من الأجسام المضادة في تركيزات عالية من الواضح أن هناك منصة أعلى وأسفل المرحلة ، المرحلة العليا إشارة قيمة نصف تركيز الأجسام المضادة المقابلة(EC50)( د ) تقارب بين مستضد الضد .
لأن مجموعة خطية من إشارة الكشف عن أداة محدودة ، عندما إشارة تتجاوز مجموعة خطية ، منحنى سوف تدخل مرحلة وهمية على منصة ، مما يجعل قياس تقارب غير دقيقة .
تركيز مستضد المغلفة مباشرة يحدد قيمة الإشارة .ولذلك ، فإن تركيز مستضد المغلفة ينبغي أن تكون صغيرة قدر الإمكان من أجل الحصول على إشارة مناسبة القيمة . انخفاض تركيز انزيم مرتبط المناعي الأجسام المضادة قد يؤدي أيضا إلى منحنى دخول كاذبة منصة المرحلة .

في عملية تطوير منهجية إليسا ، خطي نقل الإشارات الزائدة من الأجسام المضادة انزيم مرتبط يجب التحقق منها تجريبيا .
عندما إشارة لا يمكن الحصول على منصة فعالة الفترة ، فإنه يشير إلى أن تقارب بين الأجسام المضادة للمستضد ضعيفة جدا أو overcoated مستضد ، تحتاج إلى تركيز أكبر من الأجسام المضادة من أجل الحصول على جميع المستضدات التي استولت على منصة الفترة .
بسبب الحد من حساسية اليسا(> 100nM)في الأجسام المضادة للمستضد ، إليسا لا يمكن الحصول على منصة فعالة المرحلة ، ولا يمكن قياس تقارب القيم .
عندما إليسا المستخدمة لتقييم نشاط المستضد أو الأجسام المضادة ، ec50 الحصول عليها ليست أصغر ، أفضل ، إشارة يدخل( تصل إلى حد الكشف عن الصك ، انزيم مرتبط تركيز أقل )كل هذه تجعل من ec50 أصغر ، وبالتالي الحصول على بيانات خاطئة تقارب ، والتي هي أيضا عرضة للخطأ عند إليسا ينفذ تقارب القياس .
هذه المغالطات موجودة اليوم في العديد من الموردين من مستضد البروتينات في تقييم نشاط المستضد .

تقارب بين المستضدات والأجسام المضادة يتحدد هيكل التفاعل بين المستضدات والأجسام المضادة .قد يكون 0.1 نانومتر ، 1 نانومتر أو 1000 نانومتر . تقييم إليسا تقارب يعتمد على ما إذا كانت قيمة EC50 يتوافق مع قيمة تقارب ، تقارب قيمة يمكن التحقق منها من قبل العديد من الجوانب مثل الديناميكا الحرارية ، وديناميات قياس التدفق الخلوي في قياس تركيز التشبع الأسلوب .
وعلى العكس من ذلك ، عندما لا توجد طريقة الاليزا مثل إشارة دخول مرحلة منصة كاذبة( تصل إلى حد الكشف عن الصك ، انزيم مرتبط تركيز أقل )إذا كانت قيمة ec50 تساوي مغالطة ، يمكن أن تعكس قيمة تقارب حقيقي . . . . . . .

تطوير المنهجية باستخدام اليسا يتطلب تحديد الهدف من التطبيق ، والجزيئات الكمية و تقارب .
لأغراض التطبيق المختلفة ، وتركيز الجرعات النسبية للمستضد والأجسام المضادة تختلف اختلافا كبيرا ، وهناك منحنيات الجرعات المختلفة ،يمكن للقراء إجراء دراسة مقارنة مع الجزء السابق من " تطوير أساليب إليسا - تطوير الأساليب الكمية في الكشف عن الجزيئات الحيوية " لتوضيح الفرق .

هذا الموضوع هو المشاركة هنا ، ونحن سوف يجتمع مرة أخرى في المرة القادمة !

مقالات سابقة

أووهاوس يعزز توطين لقاح فيروس الورم الحليمي البشري
الحقيقة حول الترميز الجيني - فك تشفير crispr
ماذا عن الناس الذين يريدون شراء مختبر هزاز ؟
اختبار تلك الأشياء . . . . . . . هل لديك جهاز تجريبي ضرب مرة أخرى ؟
تطوير طريقة الاليزا للباحثين في مجال المستحضرات الصيدلانية البيولوجية *
مرض البلهارسيا ، قاتل صحي أسوأ من سرطان الدم
تطبيق أوهاس هزاز في معالجة الدم

هل تريد أن تعرف المزيد عن منتجات ذات جودة عالية ؟ يرجى الاتصال بنا ، وترك المعلومات الخاصة بك ، والمهندسين المحترفين لدينا سوف نكون سعداء لخدمتك !
قراءة المزيد من المقالات الرائعة ، مرحبا بكم في الاهتماممايكرو الرسالة رقم الجمهورالولايات المتحدة الأمريكية! يا إلهي